Prípravná fáza: V tomto počiatočnom štádiu sa 6-uhlíková molekula cukru (zvyčajne glukóza) dvakrát fosforyluje za vzniku fruktóza-1,6-bisfosfátu. Tento proces vyžaduje vstup 2 molekúl ATP a využíva enzýmy hexokinázu a fosfofruktokinázu.
Fáza štiepenia: Počas tejto fázy sa fruktóza-1,6-bisfosfát štiepi na dva 3-uhlíkové cukry:glyceraldehyd-3-fosfát (GAP) a dihydroxyacetónfosfát (DHAP). Tieto 2 molekuly sú vzájomne konvertibilné a obe môžu postupovať ďalej v dráhe.
Fáza vyplácania: Táto posledná fáza zahŕňa konverziu GAP a DHAP na pyruvát, pričom v tomto procese vznikajú ATP a NADH. Tento stupeň pozostáva z niekoľkých enzymatických krokov, vrátane fosforylácie na úrovni substrátu a oxidačných reakcií. Nakoniec sa vytvoria 2 molekuly pyruvátu spolu s celkom 4 molekulami ATP a 2 molekulami NADH na každú molekulu glukózy, ktorá vstupuje do glykolýzy.